一、摘要：

1.标本的採取和保存

    可用作elisa測定的标本十分廣泛，體液(如血清)、分泌物(唾液)和排洩物(如尿液、糞便)等均可作标本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些标本可直接進行測定(如血清、尿液)，有些則需經預處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清爲标本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等於(yú)血清。制備血漿标本需借助於(yú)抗凝劑，而血清标本隻要待血清自然凝固、血kuai收縮後即可取得。除特殊情況外，在醫學檢驗中均以血清作爲檢測标本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清标本可按常規方法採(cǎi)集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP爲标記的ELISA測定中，溶血标本可能會增加非特異性顯色。 血清标本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有内源性HRP，也會産生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深
。一般說來，在5天内測定的血清标本可放置於(yú)4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解後，蛋白質局部濃縮
，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下颠倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉澱的血清标本應先離心或過濾，澄清後再檢測。反複凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清标本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自採(cǎi)集時就應注意無菌操作，也可加入适當防腐劑。

2.加樣 

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加标本，加酶結合物，加底物。加樣時應将所加物加在LEISA闆孔的底部，避免加在孔壁上部，並(bìng)注意不可濺出，不可産生氣泡。 加标本一般用微量加樣器，按規定的量加入闆孔中。每次加标本應更換吸嘴，以免發生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋後再加樣。也可在闆孔中加入稀釋液，再在其中加入血清标本，然後在微型震蕩器上震蕩1分鍾以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。

3.試劑的準備 

    按試劑盒說明書的要求準備(bèi)實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用於(yú)洗滌的，應爲新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡後使用
。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。

4. 保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加标本和加酶結合物後。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱爲溫育(incubation)，有人稱之爲孵育，在ELISA中似不恰當。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合隻在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法爲例，加入闆孔中的标本，其中的抗原並不是都有均等的和固相抗結合的機會，隻有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其後加入的酶标記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是爲什麽ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
    溫育常採用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合适溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，産物的可達。爲加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜採用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更爲*，以形成zui多的沉澱。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予採用。