PCR檢測步驟

1.将參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質粒載體上，構建一種可同時用於參照基因以及待測目的基因擴增檢測的标準品，並将所得标準品按照濃度梯度稀釋後同時用於繪制參照基因以及待測目的基因的标準曲線；

2.待測樣本與步驟1所述标準品經同步進行實時熒光定量PCR擴增後
，目的基因與參(cān)照基因按照各自的标準曲線計算各自的拷貝(bèi)數，計算待測樣本的目的基因與參(cān)照基因拷貝(bèi)數比值，即得目的基因的拷貝(bèi)數相對定量檢測結果。

其中步驟1爲：将參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質粒載體上，構建一種可同時用於(yú)參照基因以及待測目的基因擴增檢測的标準品，並(bìng)将所得标準品按照濃度梯度稀釋後同時用於(yú)繪制參照基因以及待測目的基因的标準曲線。

其中所述參照基因爲本領域常規參照基因，較佳地管家基因，優選地爲RPPH1的擴增區域，其中所述質粒載體爲本領域常規質粒載體，較佳地爲PCR克隆載體，優選地爲TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地爲pMD18-T載體。其中所述标準品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地爲1：1。由於(yú)标準品中待測目的基因與參照基因的比例爲1:1，解決瞭(le)目前相對标準曲線法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關系難以控制的問題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性。

步驟2爲：待測樣本與步驟(1)所述标準品經同步進行實時熒光定量PCR擴增後
，目的基因與參(cān)照基因按照各自的标準曲線計算各自的拷貝(bèi)數，計算待測樣本的目的基因與參(cān)照基因拷貝(bèi)數比值，即得目的基因的拷貝(bèi)數相對定量檢測結果
。

其中所述待測(cè)目的基因爲本領域常規(guī)待測(cè)目的基因，較佳地爲腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地爲HER2基因的擴增區域，所述熒光定量PCR擴增爲本領域常規(guī)熒光定量PCR擴增方法，所述熒光定量PCR擴增方法較佳地爲多通道熒光定量PCR擴增，更佳地爲雙通道熒光定量PCR擴增。

實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信号積累實時監測(cè)整個PCR進程，後通過标準曲線對未知模闆進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增産(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設計的引物來指示擴增的增加。運用該技術可以對DNA、RNA樣品進行定量（包括絕對定量和相對定量）和定性分析。

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